發(fā)布時(shí)間：2023-07-17
2023年7月17日，《自然·方法》期刊在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳躍軍研究組題為《利用CRISPR條形碼技術(shù)全面繪制小鼠腦內(nèi)的單細(xì)胞時(shí)空譜系》的研究論文。該研究通過(guò)建立能夠應(yīng)用于小鼠體內(nèi)任意組織器官的譜系示蹤新技術(shù)——CREST，解析了小鼠中腦在胚胎發(fā)育過(guò)程中的單細(xì)胞時(shí)空譜系圖譜，揭示了小鼠中腦發(fā)育過(guò)程中新的譜系分化路徑和分子調(diào)控機(jī)制。CREST技術(shù)為高通量解析小鼠組織器官發(fā)育的單細(xì)胞譜系提供了全新的工具，為從譜系視角研究各種發(fā)育疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究工具。
哺乳動(dòng)物的發(fā)育伴隨高度復(fù)雜的細(xì)胞命運(yùn)特化過(guò)程——從多潛能干細(xì)胞逐步分化成熟為各種類型的細(xì)胞，進(jìn)而形成高度異質(zhì)性的組織器官。解析每個(gè)細(xì)胞在這一過(guò)程中的完整發(fā)育歷程（即“譜系”）是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的重要目標(biāo)之一。譜系的研究有助于人們理解生命個(gè)體的發(fā)育，解析發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，并為基于細(xì)胞治療的再生醫(yī)學(xué)研究中不同類型細(xì)胞藥物的體外分化和制備，提供關(guān)鍵依據(jù)和線索。
近年來(lái)，人們?yōu)榻馕霾溉閯?dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的譜系做出了巨大努力。然而，傳統(tǒng)基于重組酶技術(shù)的譜系示蹤通量有限，一般只能示蹤1-2個(gè)譜系。最近的一些研究通過(guò)在側(cè)腦室注射條形碼標(biāo)記的病毒，對(duì)腦室區(qū)（Ventricular Zone，VZ）的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序?qū)@些細(xì)胞的子代細(xì)胞進(jìn)行高通量譜系示蹤。然而，這種方法只能標(biāo)記VZ區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)全腦任意腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記，而且用病毒注射的方法標(biāo)記早期胚胎中的細(xì)胞還存在技術(shù)障礙。因此，急需開發(fā)一種能夠?qū)δX內(nèi)任意細(xì)胞群體進(jìn)行高通量條形碼標(biāo)記和譜系示蹤的新方法。
陳躍軍研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)以上問(wèn)題，通過(guò)將CRISPR條形碼技術(shù)、重組酶系統(tǒng)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)相互結(jié)合，開發(fā)了一種在體高通量譜系示蹤的方法——CREST，并構(gòu)建了相應(yīng)的譜系示蹤工具小鼠品系（圖A）。利用CREST技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)繪制了較全面的中腦發(fā)育譜系圖譜，有助于深入理解中腦多種類型細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。
研究團(tuán)隊(duì)首先利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定發(fā)育時(shí)間點(diǎn)中腦不同細(xì)胞類型之間的譜系關(guān)系（圖B），發(fā)現(xiàn)了許多先前未被報(bào)導(dǎo)的具有亞區(qū)特異性的譜系關(guān)系：在翼板中，谷氨酸能神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元具有共同的譜系起源；而在基板中，這兩類神經(jīng)元具有相對(duì)獨(dú)立的起源；在底板中，谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)t與多巴胺能神經(jīng)元具有共同的起源（圖C）。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在克隆水平對(duì)祖細(xì)胞的分化命運(yùn)進(jìn)行了無(wú)偏好的分類，發(fā)現(xiàn)單個(gè)中腦祖細(xì)胞的分化命運(yùn)可以被分為六種主要類型。基于這一結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)提出了“祖細(xì)胞原型”的概念，這六種中腦祖細(xì)胞原型囊括了中腦發(fā)育過(guò)程中單個(gè)中腦祖細(xì)胞的不同分化命運(yùn)（圖D）。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在克隆水平對(duì)中腦底板神經(jīng)祖細(xì)胞的分化命運(yùn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)單個(gè)中腦底板神經(jīng)祖細(xì)胞存在三種不同的分化命運(yùn)：中腦底板神經(jīng)祖細(xì)胞經(jīng)由中腦底板神經(jīng)母細(xì)胞，有的偏好分化成多巴胺能神經(jīng)元，有的偏好分化成谷氨酸能神經(jīng)元、有的則能同時(shí)分化成多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元。通過(guò)對(duì)不同分化命運(yùn)的底板神經(jīng)母細(xì)胞差異表達(dá)基因的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，Pbx1轉(zhuǎn)錄因子在偏好產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的底板神經(jīng)母細(xì)胞內(nèi)顯著高表達(dá)（圖E）。當(dāng)Pbx1被敲除后，共釋放谷氨酸的中腦多巴胺能神經(jīng)元的比例顯著增加，這證明Pbx1在決定中腦底板來(lái)源神經(jīng)元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的關(guān)鍵作用（圖F）。這些結(jié)果展示了CREST技術(shù)在克隆水平解析細(xì)胞命運(yùn)決定分子機(jī)制中的強(qiáng)大能力。
snapCREST可以解析特定發(fā)育時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞類型之間的譜系關(guān)系，但是由于祖細(xì)胞在被用于單細(xì)胞測(cè)序后無(wú)法繼續(xù)分化，這一策略無(wú)法解析不同祖細(xì)胞類型在下一階段的分化命運(yùn)。為此，研究人員進(jìn)一步開發(fā)了基于CREST的“連拍”策略（pandaCREST）。該策略結(jié)合了克隆分離策略、類器官培養(yǎng)技術(shù)與CREST技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了發(fā)育過(guò)程中單個(gè)祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息及其分化潛能的同時(shí)獲得（圖G）。通過(guò)pandaCREST，研究人員解析了中腦不同轉(zhuǎn)錄組定義的祖細(xì)胞群的分化命運(yùn)。進(jìn)一步的單克隆分析發(fā)現(xiàn)，在同一轉(zhuǎn)錄組定義的祖細(xì)胞群內(nèi)，單個(gè)祖細(xì)胞具有不同的分化命運(yùn)，并且在轉(zhuǎn)錄組水平上，不同分化命運(yùn)的祖細(xì)胞仍存在微小的差異，提示同一祖細(xì)胞類群內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的不同分化命運(yùn)是預(yù)先確定的（圖H）。
CREST技術(shù)是一種高通量譜系示蹤的新方法，它不僅可以在單細(xì)胞水平解析體內(nèi)的發(fā)育譜系，而且可以在克隆水平解析發(fā)育過(guò)程中命運(yùn)決定的分子機(jī)制，是目前已知的唯一可以對(duì)腦內(nèi)任意細(xì)胞群體進(jìn)行高通量譜系示蹤的方法，為解析全腦發(fā)育譜系圖譜提供了關(guān)鍵技術(shù)。通過(guò)將CREST 小鼠與任意組織器官或特定類型細(xì)胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技術(shù)可以被廣泛地應(yīng)用于其他組織器官的發(fā)育譜系研究，并可以用于疾病、損傷或再生條件下的譜系研究。這為在單細(xì)胞和單克隆水平研究不同組織器官的發(fā)育和疾病發(fā)生提供了通用技術(shù)方法。
該研究由中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心博士研究生謝連順與中國(guó)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)健康所博士研究生劉恒心，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實(shí)驗(yàn)室魏武研究員的指導(dǎo)下完成。中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心游致文博士、王露悅博士、李依紋博士、博士研究生章馨月、何慧博士、職工袁停立、鄭文平博士，復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院研究生計(jì)筱珊，上海躍賽生物科技有限公司吳子彥博士，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院熊曼研究員，復(fù)旦大學(xué)周文浩教授，中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心蒲慕明院士為本研究提供了重要幫助。該研究得到了中國(guó)科學(xué)院、科技部、基金委和上海市科委的資助。
附件下載： 
